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生物知識

細胞培養的污染檢測、預防與去除

作者:admin 來源:本站 發布時間: 2019-03-17 21:57  瀏覽次數:
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在培養細胞過程中,最讓人憂的事情就是細胞發生污染,為了應對細胞污染的問題,主要從兩方面入手,一是預防,二是發生污染后的補救措施。

    然而,應對不同細胞污染有不同的措施,其中,培養細胞的污染主要包括真菌污染、細菌污染、支原體污染、病毒污染、化學物質的污染、不同細胞之間的污染,接下來,就按照不同類型的細胞培養污染給出相應的鑒定、預防和污染去除方法。


 

一. 真菌污染

鑒定:污染培養細胞的真菌種類很多,常見的主要有:煙曲霉、黑曲霉、毛霉、白色念球菌、酵母菌等。真菌污染一般肉眼可見,短期內培養液大多不發生渾濁,但形成白色或淺黃色漂浮物。在倒置的顯微鏡下可見細胞之間有縱橫交錯的菌絲,值得注意的是,不要把培養皿外的菌絲誤以為在培養液內,若發現有,及時用酒精棉球擦拭。

 

                                                            菌絲圖(來源:互聯網)

預防:真菌污染屬于微生物污染,預防主要從空氣、器材、操作、血清入手。

1.     減少空氣流動,培養室和操作室要注意空氣的消毒,工作時要戴口罩。

2.     細胞培養器材消毒要徹底,盡可能的做到定期消毒,大概一周一次,若培養液漏出,則應立即消毒。

3.     實驗操作應有無菌觀念,動作要符合規范,不使用污染的器具,瓶蓋應封緊。

4.     血清生產和使用時可能受到污染,在使用前最好先檢查血清是否被污染,使用過程中也要保證不被污染。

污染去除:發生污染后,可考慮采用制霉菌素25微克每毫升或酮康唑10微克每毫升進行處理。如果細胞為腫瘤細胞,也可以嘗試用巨噬細胞和抗生素聯合處理,即將同種動物腹腔巨噬細胞加入被污染的細胞中(巨噬細胞與污染細胞比例為100:1),再加入100微克每毫升的抗生素,逐日檢測,直至檢測不到微生物,巨噬細胞不具永生性,會在培養過程中逐漸消失。如果還是無法消除污染,該細胞為高價值的腫瘤細胞,則可以將腫瘤細胞接種與BALB/c裸鼠的頸背部(每只接種4×106細胞),接種3-5只,一個月后取瘤塊進行原代培養。


二. 細菌污染

鑒定:常見的細菌污染有大腸埃希菌、白色葡萄球菌、假單胞菌等。細菌污染后,培養液在短期內會變黃色,因為有大量酸性物質產生,而且會發生渾濁。必要時可取少量培養液涂片染色檢查細菌種類,也可以向肉湯培養基中加入少量培養液,37℃培養檢測是否污染。

 

 

 

 

                                                           大腸埃希菌圖(來源:互聯網)

預防:細菌污染屬于微生物污染,預防手段與真菌污染相同,在這基礎上,還可以在培養液上加入雙抗,即各100單位/毫升的青霉素和鏈霉素。

污染去除:若發生污染,可嘗試使用5-10倍常用抗生素劑量的沖擊方法,加藥作用24-28h,,再換常規培養基培養。如果細胞為腫瘤細胞,也可以嘗試用巨噬細胞和抗生素聯合處理,即將同種動物腹腔巨噬細胞加入被污染的細胞中(巨噬細胞與污染細胞比例為100:1),再加入100微克每毫升的抗生素,逐日檢測,直至檢測不到微生物,巨噬細胞不具永生性,會在培養過程中逐漸消失。


三. 支原體污染

鑒定:支原體是一類缺乏細胞壁的細胞,呈高度多形性,細胞培養中被支原體污染是比較常見的問題,因為污染來源太多,包括工作環境、操作者、血清、實驗器材等,鑒定的方法如下。

1.     相差顯微鏡觀察。其中可以采用直接觀察或地衣紅染色觀察,直接觀察時,位于細胞表面和細胞之間的暗色微小顆粒為支原體,但要與線粒體區分。

2.     熒光染色法。將細胞接種于蓋玻片上,在細胞未長滿前取出玻片,用不含酚紅的Hank's液漂洗后,再用1:3醋酸甲醇固定10min,然后用生理鹽水漂洗,置于用生理鹽水配制的 Hoechst 33258(濃度為50ul/ml)中染色10min,熒光染料將支原體內的DNA著色,染色后用蒸餾水洗1~2min,滴加pH5.5磷酸緩沖液數滴,然后置熒光顯微鏡下觀察。鏡下散于細胞周圍或附于細胞膜表面的亮綠色小點為支原體。

3.     電鏡檢查。制備電鏡標本,用掃描電鏡或透射電鏡觀察。

4.     DNA分子雜交檢查。按試劑盒說明進行,檢出率高,但方法較復雜。

5.     PCR。現有支原體PCR檢測試劑盒銷售,可按說明書檢測支原體污染。

 

 

 

:支原體污染細胞熒光圖

:無污染細胞熒光圖

圖片來源:互聯網

預防:支原體污染屬于微生物污染,預防手段與真菌污染相近,在此基礎上,可用100微克每毫升的卡那霉素抑制支原體,但可能對細胞有所損傷,盡量不加抗生素。

污染去除

1. 抗生素處理:。用100微克每毫升卡那霉素清除培養物中的支原體污染。亦有將細胞培養瓶直放,瓶內裝人含600ug/ml 卡那霉素的生長液至瓶頸部,37C孵育 18h,然后移人含200ug/ml卡那霉素的生長液,可成功處理支原體。金霉素對細胞毒性較卡那霉素大,常用濃度為100~200ug/ml。對卡那霉素、四環素有抗藥性的支原體可用泰樂菌素處理,對培養細胞無不良影響,污染細胞以50ug/ml泰樂菌素處理6天,或連續處理2代,可長期有效地清除支原體污染。

2. 高熱處理。因支原體和細胞對熱的耐受性不同,將受污染的細胞41℃作用5~10h,最長達18h,可以破壞支原體,而細胞僅少許損傷,即可恢復。對溫度敏感的細胞株不能采用這種方法。

3. 巨噬細胞和抗生素聯合處理。將同種動物腹腔巨噬細胞加入被支原體污染的細胞中(巨噬細胞與污染細胞比例為100:1),再加入100ug/ml的抗生素,結合支持物方法培養逐日檢查,直至支原體被巨噬細胞消除。

4. 鼠的傳代培養。如果還是無法消除污染,該細胞為高價值的腫瘤細胞,則可以將腫瘤細胞接種與BALB/c裸鼠的頸背部(每只接種4×106細胞),接種3-5只,一個月后取瘤塊進行原代培養。

5.  血清處理。將污染的細胞接種于含 10% 非滅活血清培養基中,孵育 6h后,去除了包括人-人雜交瘤在內的5種細胞系中污染的支原體,其中起作用的是補體成分。

6. 支原體去除試劑。用MRA處理細胞,每4天換一次液,連續處理15天。也有網友推薦MycoplasmaOUT™ Treatment試劑,用一天后,細胞恢復生長。


四. 病毒污染

 

有關病毒污染的資料不多,但一般認為病毒污染不影響細胞培養,通過PCR技術可以檢測。不過病毒污染對生產疫苗是不安全的。因此,至今,潛在病毒是細胞大量生產和疫苗、干擾素等生物制品制作的難題。有研究顯示用伽馬射線可清除牛血清的大部分病毒,現如今最值得期待的是下游工藝中除病毒過濾器的開發。


五. 細胞污染

 鑒定

1.     形態學鑒定。形態觀察是辨認細胞最簡單和最直接的方法,但我們也應意識到它有

一定的不足,因為其中多數細胞形態與不同培養環境對細胞形態的可塑性有關。例如,在單層匯合狀態心部位生長的上皮細胞,一般形態規則,呈多角形,而且邊緣清晰明確,而生長在小片邊緣同樣的細胞,形態就不規則,呈伸開狀;如果發生轉化,就會從小片上脫離,變為成纖維細胞樣的形態。

2.     種屬鑒定。染色體分析是區分物種的最佳方法。 同工酶電泳也是一種較好的診斷

檢測方法,而且比染色體分析快,但需要合適的儀器和試劑。

3.     譜系或組織標記。如細胞表面抗原、中間纖維蛋白、酶類、分化產物,根據以上物

質的差異,運用流式細胞術等技術,鑒定是否發生細胞交叉污染。

4.     STR分型。

預防:1. 實驗器材如吸管不能混用。幾種細胞同時實驗時,器材要做好專用標記。

2. 細胞培養液公用時,細胞吸管和細胞用液要分開,千萬不能用細胞吸管直接吸取細胞培養液。吸取培養液的吸管尖端不要觸及培養瓶瓶口,避免把細胞帶到培養液瓶中,防止進行其他細胞培養操作時導致細胞污染。

3. 所有轉來的細胞或自己所建的細胞系都要在早期留有充足的凍存樣本備用,一旦發生細胞交叉污染,可以復蘇早期凍存細胞來使用。

去除方法:解決細胞交叉污染的問題最好的方法就是進行單克隆化,前提是要保證原細胞株還存在。具體是通過有限稀釋法實現單克隆化,然后運用鑒定手段確保不存在其他雜細胞,即可去除細胞交叉污染。


 

六. 化學物質污染


化學污染物質包括殘存洗滌劑、細胞殘余、有毒化學藥品等,細胞直接接觸物(如培養基、生長基質、培養皿)或間接接觸物(如配制培養基的器皿、瓶塞、瓶蓋等)若被化學物質污染,將有可能直接導致細胞的死亡。如果在污染早期可用PBS清洗、稀釋有害化學物質。


綜上所述

 

 

為了防止發生污染,預防是第一位的,而且要注意實驗規范,盡量做到定期消毒,實驗人員也要有防止污染發生的意識,遇到發生污染情況可運用上述的鑒定和去除方法,不過一切的去除方法都不如一個眾所周知的習慣——保存無污染的細胞株,這才是最明智的做法。

 

圖片來源:互聯網

 

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