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生物知識

細胞都是怎么死的?各種死法及其對應的流式檢測匯總

作者:admin 來源:niwanmao 流式中文網 發布時間: 2019-03-21 22:45  瀏覽次數:
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2005年《Apoptosis, pyroptosis, and necrosis: mechanistic description of dead and dying eukaryotic cells》[1]這篇綜述將所有的細胞死亡形式都概括了一下,很直觀,那么我們同時結合這幅圖,將各種死亡形式的流式檢測手段都大致理一下,供各位做科研的朋友參考。 

  

 

 

細胞凋亡(apoptosis)

 

 

 

這種死亡是細胞的一種生理性、主動性的“自覺自殺行為”。生物體內細胞在特定的內源和外源信號誘導下,其死亡途徑被激活,并在有關基因的調控下發生的程序性死亡過程。意指細胞的死亡猶如秋天的樹葉或花瓣的凋落的死亡方式, 1973 年 Kerr 和 Wyllin 最先提出這一概念。細胞凋亡的過程大致可分為以下幾個階段:接受凋亡信號→凋亡調控分子間的相互作用→蛋白水解酶的活化(Caspase)→進入連續反應過程;手指或腳趾的發育及青蛙尾巴的退化都是細胞凋亡的結果。

 

 

 

細胞凋亡的流式檢測

細胞凋亡的流式檢測方法最完善了,我們論壇上就總結了10種從早期凋亡~晚期凋亡的方法,包括但不限于:

  • 羅丹明123、DiOC6(3)、JC-1染色

  • 用ZENON技術檢測活化CASPASES

  • 用FLICAs檢測凋亡細胞

  • 檢測PARP切割

  • ANNEXIN V法

  • 用PI檢測亞G1峰

  • 用DAPI檢測亞G1峰

  • TUNEL法檢測DNA斷裂

  • 檢測組織谷氨酰胺轉移酶

  • 熒光素標記的尸胺檢測TGase2活化

更詳細的方法學和需自配、購買的試劑可在論壇上搜索“流式細胞術檢測凋亡方法”

  

細胞自噬(Autophagy)

  一些損壞的蛋白或細胞器被雙層膜結構的自噬小泡包裹后,送入溶酶體(動物)或液泡(酵母和植物 )中進行降解并得以循環利用。1966年Duve和Wattiaux在發現溶酶體的同時發現了細胞的自吞噬現象,1977年Mortimore和Schworer發現肝細胞在處于饑餓狀態時,自吞噬對其維持自身的穩態發揮著至關重要的作用;

自噬的流式檢測

自噬的流式細胞術檢測方法雖然不多,但相對來說也算成熟。

1、吖啶橙

2、LC3-II

3、LysoTracker

(以上三種方法詳見http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-4409-1-1.html)

4、可結合膜滲透性的改變、細胞膜表面PS的反轉、線粒體膜電位降低這三個指標區分凋亡和自噬。(http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-5118-1-1.html)

 

 

 

 

 

細胞脹亡(Oncosis)

 

 

 細胞腫脹,體積增大,胞漿空泡化,腫脹波及細胞核、內質網、線粒體等胞內結構,胞膜起泡,細胞膜完整性破壞。脹亡細胞周圍有明顯炎癥反應。1910年, von Reckling-hausen在骨軟化病中發現由于缺血而腫脹壞死的骨細胞,他把這種腫脹壞死叫做Oncosis。1995年Majno和Joris為與凋亡相區別,重新引入了Oncosis的概念,把具有明顯腫脹特點的細胞死亡命名為Oncosis;

 

脹亡的流式檢測

脹亡可能很多FLOWER都不太檢測,其實流式可以測,利用Annexin V FITC和DAPI排除掉凋亡細胞和壞死細胞,然后用DiIC1(5) 和 (DiBAC4(5))檢測線粒體膜電位和漿膜電位,實時觀察細胞在25分鐘內發生的變化(如下圖),很清楚地看出疊氮鈉、Triton等引起的脹亡與凋亡、熱休克等不同之處,就是線粒體膜電位快速下降而漿膜電位輕微增高。簡單吧!

參考文獻:http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/cyto.a.21022/full

  

 

 

 

 

細胞焦亡(Pyroptosis )

 

 

  一種微生物感染等引起的程序性細胞死亡方式,其特征為依賴于半胱天冬酶-1、4、5、11,并伴有大量促炎癥因子的釋放.細胞焦亡的形態學特征、發生及調控機制等均不同于凋亡、壞死等其他細胞死亡方式。細胞焦亡廣泛參與感染性疾病、神經系統相關疾病和動脈粥樣硬化性疾病等的發生發展。

 

細胞焦亡的流式檢測

細胞焦亡我大致看了這些查閱到的文獻,發現幾乎不大用流式檢測,有些文獻(例如https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3058225/)用流式檢測,但是用PI標記細胞并結合GFP標記的細菌,檢測吞噬了這種細菌的粒細胞中PI+的細胞,就認為是焦亡,似乎從機制上算,然而如果從分子水平看是否一定需要推敲。

我個人覺得需要焦亡特異性的標記物,例如Gasdermin D,這個焦亡的終產物目前有不少多抗,但幾乎都是免疫熒光或Western上的,流式上做相關研究的同學可以試試這種一抗+熒光二抗,畢竟流式通量高,還可以結合其它熒光標記確定細胞性質。

當然,也可以檢測caspase家族,看看是否涉及到了1、4、5、11這幾個,也可以反映焦亡。

   

 

除了以上4種與感染相關性比較大的細胞死亡方式以外,我們的機體還有其它10多種細胞死亡方式,維持著正常生理功能或參與病理過程,它們分別是:

1
失巢凋亡(anoikis: suspension-induced apoptosis):正常的貼壁細胞如果長時間處于懸浮狀態就會因“無家可歸”而死亡。這是一種形式的細胞程序死亡,由與細胞外基質和其他細胞脫離接觸而誘發的;這種細胞死亡形式在1994年被首次命名為失巢凋亡。失巢凋亡對維持機體組織穩定狀態是不可缺少的,它的主要作用是防止細胞異常生長或細胞黏附到異常的細胞外基質上。抵抗失巢凋亡是腫瘤轉移的一個特點,能使腫瘤細胞通過循環系統擴散到遠處的其他器官.腫瘤細胞在脫離細胞外基質的黏附和細胞間的接觸后,通過旁自分泌以及旁分泌機制抵抗凋亡得以存活,并重新獲得附著能力得以擴散、轉移和侵襲。

 

2
吞噬死亡(phagocytosis):在哺乳動物體內中性顆粒白細胞和巨噬細胞擔任機體中的保護防御任務。免疫細胞既可以吞噬感染的病毒、細菌或其它一些顆粒,也可以對衰老的、進入編程死亡的細胞的吞噬。如占成人細胞總數1/4的紅細胞僅能成活120天, 因此人體每天必須清除大量衰老的紅細胞,這主要是靠吞噬作用即溶酶體酶的消化作用來完成。

 

3
免疫殺傷( immune killing):T細胞、B細胞和NK細胞等淋巴細胞可介導機體的細胞免疫、體液免疫和對腫瘤細胞和病毒感染細胞的殺傷作用等免疫學功能。

 

4
細胞壞死(Necrosis:accidental cell death/cell lysis)是活體內范圍不等的局部細胞死亡,死亡細胞的質膜(細胞膜、細胞器膜等)崩解、組織自溶(壞死細胞被自身的溶酶體消化),并引發急性炎癥反應。細胞受到化學因素(如強酸、強堿、有毒物質)、物理因素(如熱、輻射)和生物因素(如病原體)等環境因素的傷害,引起細胞死亡的現象;

 5

   

 

有絲分裂災難(Mitotic catastrophe)在DNA發生損害時,細胞無法進行完全的分裂從而導致四倍體或多倍體的現象。1989年,Lisa Molz等發現在酵母的一種對熱敏感的突變株中,細胞分裂時染色體分離發生異常

 

6
entosis,即有些細胞會進入到其它細胞中,然后死亡。科學家稱,這種新形式有可能成為一種抑制腫瘤的新方法。相關論文2007年11月30日發表于《細胞》(Cell)上;

 

7
興奮性中毒(Excitotoxicity)谷氨酸酯及其類似物質等神經遞質的過度刺激,使神經細胞受損及死亡的病理過程;

 

8
壞死性凋亡(necroptosis):是一種“受控”的死亡類型,不依賴于半胱氨酸家族蛋白酶活化的路徑,在這些類型的細胞死亡中,細胞會破裂,細胞內容物被釋放。它在向細胞下達死亡指令的同時,刺激了一種炎癥反應讓免疫系統知道出現了一些問題。然而,當這一細胞死亡信號通路開始出現失控時,它可以導致炎癥性疾病。壞死性凋亡還牽涉到神經退行性疾病、失血引起的腦損傷,克隆氏病、多發性硬化癥、急性心衰,以及某些病毒感染。

  9

   

 

副凋亡(Paraptosis ):一種非凋亡性細胞程序死亡,細胞漿空泡化,線粒體和內質網腫脹,但沒有核固縮現象。2000年Sperandio等在293T細胞系中超表達胰島素樣生長因子1受體(IGFIR)時發現一種與經典凋亡不同的死亡表型,并定義為Paraptosis 。

 

10
aborted apoptosis:又名Necrosis-like programmed cell death,正常的程序性死亡啟動后,半胱氨酸家族蛋白酶活化的路徑被封堵,從而終止程序性死亡轉向壞死,最后的細胞選擇選擇非胱解酶依賴凋亡路徑終止生命;

   11

 

 

細胞僵尸(Senescense,"cell zombie"),生物學老化引起的現象,一般指體外倍增50次以后由于DNA雙鏈受損、細胞中毒等引起細胞失去分裂能力;

 

12
細胞角質化(Cornification)表皮細胞會依基底細胞→棘層細胞→顆粒層細胞→角質層細胞的順序形態集資轉變,并向表層逐漸移動,最后變成角質細胞。這種表皮細胞的分化過程叫做“角質化”;
13
沃勒變性(Wallerian degeneration)切斷神經纖維后,在與神經細胞失去聯系的一側(末梢側)神經纖維,在幾天內所發生的變性。是英國生理學家沃勒(A.V.Waller 1816—1870)所研究的現象,但細胞側的纖維部分則沒有多大變化,稱此為沃勒(變性)定律;

 

         多數情況下因為一些細胞死了我們才能更健康,而意外或衰老造成的細胞死亡會卻影響機體功能正常運行,研究細胞壞死的信號、機理和調控以及它們對人體功能和疾病的影響,研究細胞壞死的方式有助于找到造成死亡的原因和解決辦法。

 References

[1] 《Apoptosis, pyroptosis, and necrosis: mechanistic description of dead and dying eukaryotic cells》: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15784530

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